CRISPR/Cas13 demuestra eficacia 'apagando' los genes en células humanas

Complejo de proteína Cas13 con ARN. /Liang Liu y otros / Cell 2017

La recientemente descubierta proteína Cas13a, un componente del sistema CRISPR/Cas, que es capaz de destruir las moléculas de ARN, se ha probado en células humanas. Los científicos del Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT, EE. UU.) han demostrado que mediante el uso de CRISPR/Cas13 se puede destruir eficazmente el ARNm de los genes seleccionados, apagando su actividad. Los científicos adaptaron la forma inactiva de Cas13a, capaz de unir pero no de desintegrar el ARN, para realizar un seguimiento de la localización de las moléculas de ARN dentro de las células. El estudio se publica en Nature.

En este nuevo trabajo, los científicos han demostrado que Cas13a de la bacteria Leptotrichia wadei se puede utilizar en células humanas y en células de plantas, y que el sistema CRISPR/Cas13 puede sustituir eficazmente al ARN interferente (una molécula de ARN que suprime la expresión de genes específicos mediante mecanismos conocidos globalmente como ribointerferencia o interferencia por ARN). Para empezar, los autores optimizaron el componente de nucleótidos del gen Cas13 de modo que la proteína se sintetizara eficazmente en células eucariotas, y le cosieron la secuencia que proporciona la entrega al núcleo. Verificaron la eficacia de la escisión del ARN en dos líneas celulares humanas y células de arroz. La eficacia al apagar el gen que codifica la luciferasa  (una clase de enzimas oxidativas utilizados en bioluminiscencia) fue bastante alta en todas partes, aproximadamente el 75%.

Comparación de la eficiencia y exactitud del sistema CRISPR / Cas13a y el sistema de interferencia de ARN. /Omar O. Abudayyeh y otros / Nature 2017

Luego, los autores probaron la efectividad del sistema para suprimir la actividad de varios de sus propios genes en células de melanoma humano y fibroblastos. Con ayuda de Cas13, los autores fueron capaces de reducir significativamente el número de transcriptores de genes, que utilizando el ARN interferente no pudieron reprimir (MALAT1 y XIST).

La introducción de mutaciones en el dominio catalítico de la proteína produjo que Cas13a dejara de cortar el ARN, y no se produjo la reducción de la cantidad de transcripciones. La capacidad del mutante inactivo dCas13a de unir específicamente las moléculas de ARN fue usada como un método para monitorizar los ARN matrices en el citoplasma. Para ello se tuvo que modificar a la proteína dCas13a de manera que en ausencia de la diana se centrara en el núcleo y suprimiera su propia transcripción. En el ejemplo ARNm del gen de la actina (ACTB) los autores han demostrado que con dCas13a es posible detectar la acumulación del ARN en el citoplasma en la composición de gránulos de estrés- agrupaciones que se forman en condiciones desfavorables para la célula-. En presencia del ARN guía para el gen actina, dCas13a unió el RNAm de este gen y pasó al citoplasma, y ​​en presencia del ARN de control, que no lo envió a ningún lado, fue detectado en el núcleo.

Cas13a modificado se puede utilizar para monitorear ARNm. Con el fin de localizar la proteína no unida a la diana en el núcleo, le cosieron un dominio de unión con ADN y un dominio represor (c). En presencia de ARN guiá para el gen ACTB, la proteína se une al ARNm del gen (d, f). Las imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia de Cas13a, fusionada con la proteína fluorescente verde, se ve que el ARNm del gen ACTB es propenso a acumularse en el citoplasma de una composición de gránulos de estrés. NT guía de referencia de ARN no corresponde a ningún gen.
Omar O. Abudayyeh y otros / Nature 2017

De acuerdo con Constantino Severinov, que participó en el descubrimiento de la nueva proteína, la aplicación práctica en células de la nueva proteína Cas con actividad de ARN era casi imposible. Sin embargo, sus colegas demostraron rápidamente que esto no es así. ¿El Cas13 llegará a ser una herramienta de laboratorio tan popular e indispensable, como el ARN interferente y su proteína hermana Cas9? El tiempo lo dirá.

Daria Spasskaya

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